Asociación entre la producción de partículas del virus del papiloma humano y la gravedad de la papilomatosis respiratoria recurrente

Nov 21, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 5514 (2023) Citar este artículo

653 Accesos

1 Altmetric

Detalles de métricas

La papilomatosis respiratoria recurrente (RRP) tiene un amplio rango de gravedad. Investigamos la relación entre la producción de partículas del virus del papiloma humano (VPH) y la gravedad de la RRP. Desde septiembre de 2005 hasta junio de 2021, se incluyeron 68 muestras de PRR (de 29 pacientes). Se determinó el tipo de VPH. Se evaluó la carga viral del VPH, el estado físico y las características demográficas y clínicas. Se realizó inmunohistoquímica (IHC) para p16, Ki-67, L1 y E4. Utilizamos NanoSuit-CLEM (microscopía correlativa de luz y electrónica) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) para examinar las muestras. El número total de cirugías en casos VPH positivos y VPH negativos fueron 3,78 (n = 55/68, rango: 1-16) y 1,30 (n = 13/68, rango: 1-3), respectivamente (p = 0,02 ). IHC mostró que L1 y E4 estaban correlacionados y expresados ​​en la superficie del tumor. NanoSuit-CLEM y TEM revelaron partículas de VPH en núcleos positivos para L1. Los casos positivos para L1 IHC tuvieron un intervalo quirúrgico más corto (p < 0,01) y cirugías más frecuentes (p = 0,04). P16 IHC, la carga viral y el estado físico no se asociaron con la gravedad de la enfermedad. Este estudio visualizó la producción de partículas de VPH en RRP por primera vez. La infección persistente por partículas de VPH se asoció con la gravedad. Sugerimos L1 IHC para evaluar la gravedad de RRP además de la puntuación de Derkay.

La papilomatosis respiratoria recurrente (PRR) es un tumor benigno que a menudo es causado por el virus del papiloma humano (VPH) tipo 6 o 111,2. La PRR también se conoce como papilomatosis laríngea (LP)3. En general, la afectación por VPH se informa en el 80-96,9% de los pacientes4,5,6; sin embargo, algunos estudios informaron una tasa más baja de detección de VPH de aproximadamente un 60 %1,2. Además, algunos informes no han examinado la participación del VPH7,8,9. Algunos pacientes permanecen en remisión después de una sola cirugía, mientras que otros desarrollan transformación maligna después de múltiples cirugías y tienen resultados desfavorables10,11. La puntuación de Derkay, que evalúa la gravedad de la enfermedad en función de los hallazgos clínicos, se utiliza a menudo para determinar la gravedad de la RRP12. Sin embargo, se han realizado pocos estudios para investigar la gravedad clínica de la enfermedad en función de su patogenia, como el ciclo de vida del VPH. Dado que el ADN del VPH se detecta en la mucosa laríngea de los pacientes en remisión, se cree que la infección persistente por VPH está implicada en la patogenia de la RRP13. Sin embargo, ningún informe ha examinado la asociación entre la participación del VPH (o el estado de las partículas de VPH producidas por los tumores) y la gravedad de la enfermedad.

El método NanoSuit es una técnica biomimética inspirada en la capacidad de observar larvas de Drosophila vivas utilizando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (FE-SEM), que requiere condiciones de alto vacío14,15. El método NanoSuit-CLEM (microscopía de luz y electrónica correlativa), que aplica la tecnología NanoSuit, es una técnica que forma una nanomembrana en tejidos patológicos, preservando así el contenido de agua del tejido y manteniendo su estructura tridimensional, mientras que el área bajo observación al microscopio óptico se observa con un SEM16. El proceso se puede completar en unos minutos y la observación FE-SEM se puede realizar fácilmente. Previamente examinamos varios tejidos patológicos como el tracto gastrointestinal y la glándula salival utilizando el método NanoSuit-CLEM17,18,19. Además, anteriormente informamos métodos estándar de observación para varios virus, como el citomegalovirus, el virus de la varicela zoster y el VPH, utilizando el método NanoSuit-CLEM20.

Se ha informado que las expresiones de ARNm de E4 y E5 de VPH son altas en RRP y pueden estar involucradas en la patogénesis de la enfermedad21,22. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la producción activa de partículas de VPH estaría asociada con la gravedad de la RRP porque E4 está involucrado en la formación y liberación de partículas de VPH.

En este estudio, intentamos dilucidar el ciclo de vida del VPH en RRP mediante la observación de partículas de VPH mediante el método NanoSuit-CLEM. Además, nuestro objetivo era demostrar que la producción activa de partículas de VPH está asociada con la gravedad de la enfermedad.

Las características de los pacientes se resumen en la Tabla 1 y los datos detallados están disponibles en la Tabla complementaria S1. Realizamos un análisis de secuenciación directa para determinar el tipo de VPH (Figura complementaria S1). La edad media fue de 44,83 (rango: 30-69, DE: 8,67), 57,00 años (rango: 45-69, DE: 12,53) y 60,10 (rango: 37-86, DE: 16,04) años en pacientes con VPH tipo 6, 11 y negativo, respectivamente. Todos los casos fueron PRR de inicio en el adulto y el tratamiento se realizó en quirófano bajo anestesia general. Ninguno de los pacientes recibió la vacuna contra el VPH. Los pacientes con RRR eran en su mayoría hombres (n = 25/29, 86,2%), tenían antecedentes de tabaquismo (n = 23/29, 79,3%) y tenían antecedentes de consumo de alcohol (n = 24/29, 82,8%) . El número total de cirugías fue de 3,78 (n = 19/29, rango: 1-16) en casos VPH positivos y 1,30 (n = 10/29, rango: 1-3) en casos VPH negativos (p = 0,02). ). Además, la puntuación de Derkay fue de 6,27 (n = 55/68, rango: 3-14) en los casos VPH positivos y de 4,84 (n = 13/68, rango: 3-8) en los casos VPH negativos (p = 0,02). ). Sin embargo, no se identificaron diferencias estadísticamente significativas en el número total de cirugías y las puntuaciones de Derkay para los tipos de VPH 6 y 11 (p = 0,10). No se observaron casos de lesiones diseminadas en el tracto respiratorio inferior. La transformación maligna ocurrió en tres casos, todos los cuales eran VPH negativos.

Los casos de RRP positivos para VPH a menudo mostraban coilocitosis en la superficie del tumor (área entre las líneas de puntos) (Fig. 1A). En la superficie del tumor, principalmente en lesiones coilocíticas, el núcleo fue positivo para inmunohistoquímica (IHC) L1, que es la proteína de la cápside del VPH, y la membrana celular fue positiva para ARNm y proteína E4, que están implicados en la formación de partículas de VPH. y suelte (Fig. 1B-E). Tanto L1 como E4 se expresan en una distribución similar en la superficie del tumor, con algunos sitios de ambos positivos en la misma célula (flecha) (Fig. 1F). P16 IHC mostró una débil dispersión en la tinción (Fig. 1G). La tinción con Ki-67 se observó principalmente en la capa basal, y el porcentaje de células positivas disminuyó hacia la superficie del tumor (Fig. 1H).

Hallazgos patológicos. (A) Se observa una lesión coilocítica con atipia nuclear y vacuolas perinucleares en la superficie tumoral (área entre las líneas de puntos). (B,C) [(C) es una ampliación del cuadrado en (B)]: HPV L1 IHC que muestra células positivas en lesiones coilocíticas de la superficie del tumor (flecha). (D) Hibridación in situ de ARN de membrana celular expresada por E4 de VPH en lesiones coilocíticas de la superficie tumoral. (E) HPV E4 IHC y la hibridación in situ de ARN son positivos para HPV E4 para la misma lesión. (F) HPV L1 y HPV E4 se expresan en una distribución similar en la superficie del tumor, con algunos sitios de ambos positivos en la misma célula (flecha). Marrón indica HPV L1 y rojo indica HPV E4. (G) P16 IHC muestra una débil dispersión en la tinción. (H) La tinción IHC con Ki-67 se observa principalmente en la capa basal, y el porcentaje de células positivas disminuye hacia la superficie del tumor. Solo (C) se observa en un campo de visión de 400 ×, mientras que los demás se observan en un campo de visión de 200 ×. Las barras indican 100 μm. VPH Virus del papiloma humano, IHC Inmunohistoquímica.

Utilizamos la puntuación inmunorreactiva (IRS) para evaluar la tinción IHC de p16 (Fig. S2 complementaria). P16 IRS fue estadísticamente significativo en los casos VPH positivos en comparación con los casos negativos (p < 0,01). Sin embargo, no hubo diferencia estadísticamente significativa entre los tipos de VPH 6 y 11 (p = 0,62). (Fig. 2A). El índice MIB-1 fue significativamente mayor en los casos VPH positivos que en los casos VPH negativos (p < 0,01). Sin embargo, no hubo diferencia estadísticamente significativa entre los tipos de VPH 6 y 11 (p = 0,87) (Fig. 2B). Comparando los casos positivos y negativos de L1 IHC, el índice MIB-1 fue estadísticamente mayor en los casos positivos (p < 0,01) (Fig. 2C). De manera similar, E4 IHC fue estadísticamente mayor en los casos VPH positivos (p < 0,01) (Fig. 2D).

Evaluación cuantitativa de los hallazgos patológicos. (A) La tinción de P16 es estadísticamente significativa en casos positivos para VPH, casos positivos para VPH tipo 6 y casos positivos para VPH tipo 11 en comparación con casos negativos (p < 0,01, p = 0,02 y p = 0,02, respectivamente). (B) El índice MIB-1 es estadísticamente significativo en casos positivos para VPH, casos positivos para VPH tipo 6 y casos positivos para VPH tipo 11 en comparación con casos negativos (todos p < 0,01). (C) El índice MIB-1 es significativamente mayor en los casos VPH L1 positivos que en los casos negativos (p < 0,01). (D) El índice MIB-1 es estadísticamente significativo en los casos VPH E4 positivos que en los casos negativos (p < 0,01). * indica p < 0,05 y ** indica p < 0,01. VPH Virus del papiloma humano.

Intentamos identificar partículas de VPH en secciones fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE). Seleccionamos el Caso 5-2, que era VPH tipo 11 positivo y bien expresado L1 IHC. Primero, realizamos L1 IHC y fotografiamos los sitios positivos (Fig. 3A). Posteriormente, se realizó la incubación con osmio al 1% y la deposición de vapor de osmio. La sección de flecha del núcleo L1 IHC positivo se identificó mediante FE-SEM (Fig. 3B). Las células positivas para L1 se mejoraron mediante la reacción de osmio con 3–3′-diaminobencidina (DAB). La observación del núcleo con aumentos crecientes reveló la presencia de numerosas micropartículas (Fig. 3C-G). Las partículas típicas de aproximadamente 50 a 60 nm, del mismo tamaño que las partículas de HPV, se indican con puntas de flecha (Fig. 3G).

Detección de partículas de VPH en células positivas para VPH L1. (A) Se realiza HPV L1 IHC y la flecha indica el objeto de observación. Los núcleos celulares se indican mediante flechas. Se observa un campo de visión de 400 ×. La barra indica 100 μm. (B–G) Se observan núcleos celulares VPH L1 positivos para IHC mediante el método NanoSuit-CLEM. Los núcleos están llenos de micropartículas. Las partículas típicas de aproximadamente 50 a 60 nm, del mismo tamaño que las partículas de VPH, se indican con puntas de flecha (G). El campo de visión de las imágenes es de 500 × (B), 3000 × (C), 10 000 × (D), 30 000 × (E), 50 000 × (F) y 100 000 × (G). Las barras indican 100 μm (B), 10 μm (C), 5,0 μm (D), 1,0 μm (E), 1,0 μm (F) y 500 nm (G). (H) Se realiza HPV L1 IHC. La flecha indica el objeto de observación. El campo de visión es de 200 × . Las barras indican 100 μm. (I, J) Se observan núcleos de células positivas para VPH L1 IHC utilizando el método NanoSuit-CLEM. Los núcleos están llenos de micropartículas. Los campos de visión son 5000 × (I) y 30 000 × (J). Las barras indican 10 μm (I) y 1,0 μm (J). (K–M) Las áreas se observan mediante el método NanoSuit-CLEM utilizando TEM. Se observan micropartículas de aproximadamente 50 a 60 nm de tamaño en el núcleo y se determina que son partículas de VPH. Las partículas de VPH representativas se indican con puntas de flecha (M). La ampliación es de 5000 × (K), 30 000 × (L) y 50 000 × (M). Las barras indican 2,0 μm (K), 200 nm (L) y 200 nm (M). CLEM Microscopía óptica y electrónica correlativa, VPH Virus del papiloma humano, IHC Inmunohistoquímica.

A continuación, intentamos observaciones TEM de las micropartículas en el núcleo usando FE-SEM. Se realizó IHC para L1 (Fig. 3H), se aplicó la solución NanoSuit II y se examinó la muestra usando FE-SEM. Los núcleos celulares positivos para L1 se llenaron con micropartículas (Fig. 3I, J). A continuación, el tejido observado en los portaobjetos de vidrio se incrustó en resina epoxi y se prepararon y observaron mediante TEM secciones de muestras ultrafinas. Los mismos núcleos observados por FE-SEM también se observaron usando TEM. Se encontraron numerosas micropartículas de aproximadamente 50 a 60 nm en los núcleos de las células positivas para L1 (Fig. 3K-M). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que las partículas en los núcleos positivos para L1 eran partículas de VPH.

Además, intentamos determinar si las partículas de VPH aparecen de manera diferente en cada tipo de VPH y cómo se forman las partículas. Tanto en los casos positivos para el VPH tipo 6 como para el tipo 11, la IHC de L1 fue fuertemente positiva usando microscopía óptica en las capas superficiales del tumor, y se observó que estas células estaban llenas de micropartículas en el núcleo usando FE-SEM (Fig. 4A, B,G,H). En las capas ligeramente inferiores, en los casos positivos para los tipos 6 y 11 de VPH, la IHC de L1 fue ligeramente positiva en el microscopio óptico, y las estructuras de partículas en el núcleo se redujeron en número y fueron indistintas (Fig. 4A, C, G, I) . No se encontraron células positivas para L1 IHC en la capa granular, espinosa y basal usando microscopía óptica, y no se observaron estructuras de micropartículas en el núcleo (Fig. 4A, D-G, J-L). No se observaron diferencias morfológicas en las micropartículas entre los tipos de VPH 6 y 11. En el caso de VPH negativo, no se encontraron células L1 IHC positivas mediante microscopía óptica y no se observaron estructuras de micropartículas en los núcleos (Fig. 4M-R) .

Proceso de formación de partículas de VPH. (A–F) El proceso de formación de partículas en el caso del VPH tipo 6. Se realiza HPV L1 IHC y las flechas indican el objeto de observación. Se observa un campo de visión de 200 ×. La barra indica 100 μm (A). En áreas donde HPV L1 IHC está fuertemente teñido (B), se observan numerosas partículas de HPV, mientras que en áreas donde HPV L1 IHC está débilmente teñido (C), el número de partículas de HPV se reduce y algunas partículas parecen estar inmaduras. Áreas donde las lesiones HPV L1 IHC negativas no muestran partículas de HPV (D–F). Con un campo de visión de 50 000 ×, la barra blanca indica 1,0 μm (B–F). (G–L) El proceso de formación de partículas en los casos de VPH tipo 11. Se realiza HPV L1 IHC y las flechas indican el objeto observado. Se observa un campo de visión de 200 ×. La barra negra indica 100 μm (G). En áreas donde HPV L1 IHC se tiñe intensamente (H), se observan numerosas partículas de HPV, mientras que en áreas donde L1 se tiñe débilmente (I), la cantidad de partículas de HPV se reduce y algunas parecen inmaduras. Áreas donde las lesiones HPV L1 IHC negativas no muestran partículas de HPV (J–L). Con un campo de visión de 50 000 ×, la barra blanca indica 1,0 μm (H–L). (M–R) Caso VPH negativo. Se realiza HPV L1 IHC y las flechas indican el objeto observado. Se observa un campo de visión de 200 ×. La barra negra indica 100 μm (M). No se observan partículas de VPH (N–R). Con un campo de visión de 50 000 ×, la barra blanca indica 1,0 μm (N–R). VPH Virus del papiloma humano, IHC Inmunohistoquímica.

A continuación, examinamos la gravedad clínica de los casos positivos para L1 IHC, que se caracterizan por la producción activa de partículas de VPH. En la Fig. 5A, el color de la barra indica el momento del intervalo quirúrgico y la longitud representa cada intervalo quirúrgico. La estrella indica L1 IHC positivo. El número de casos que fueron L1 IHC positivos se distribuyó de manera desigual, el número de cirugías fue alto y el intervalo quirúrgico fue corto (Fig. 5A). El número de cirugías fue significativamente mayor en pacientes con IHQ L1 positiva (p = 0,04) (fig. 5B). Además, el intervalo quirúrgico fue significativamente más corto en los pacientes positivos para IHC L1 (p < 0,01) (Fig. 5C).

Asociación entre L1 IHC y gravedad clínica. (A) HPV L1 IHC es positivo en ciertos casos, con un alto número de cirugías e intervalos quirúrgicos cortos. El eje vertical indica el número de casos y el eje horizontal indica el número de días. El color de la barra indica el momento del intervalo quirúrgico y la longitud representa cada intervalo quirúrgico. Las estrellas indican la positividad de HPV L1 IHC. (B) El número total de cirugías es significativamente mayor en los casos positivos para IHC L1 (p = 0,04). (C) El intervalo entre cirugías es significativamente más corto en los casos positivos para IHC L1 (p < 0.01). *Indica p < 0,05 y ** indica p < 0,01. VPH Virus del papiloma humano, IHC Inmunohistoquímica.

A continuación, examinamos la carga viral y el estado físico. La carga viral del VPH no difirió entre los tipos de VPH 6 y 11 (p = 0,96) (fig. 6A), y el número de casos de VPH tipo 11 fue significativamente menor en E2/E6 (p < 0,01) (fig. 6B). Este resultado indica que el VPH tipo 11 está más integrado que el tipo 6. La carga viral del VPH y E2/E6 no mostró correlación con el índice MIB-1 (r = 0,07, p = 0,66 y r = 0,12, p = 0,44) (Fig. 6C,D).

Evaluación de la carga viral del VPH y el estado físico. (A) La carga viral no muestra diferencia entre los tipos de VPH 6 y 11 (p = 0,96). (B) Los niveles de VPH tipo 11 son significativamente más bajos en E2/E6 (p < 0,01). (C) La carga viral no muestra correlación con el índice MIB-1 (r = 0,07, p = 0,66). (D) E2/E6 no muestra correlación con el índice MIB-1 (r = 0,12, p = 0,44). **Indica p < 0,01. VPH Virus del papiloma humano.

También evaluamos la correlación entre la puntuación de Derkay y la IHC, la carga viral del VPH, el estado físico y el intervalo quirúrgico. La positividad de IHC L1 se definió como 1 y negativa como 0. La positividad de IHC L1 se asoció con una puntuación de Derkay alta (odds ratio: 1,28, intervalo de confianza del 95 %: 1,04–1,57, p = 0,02). El índice MIB-1 y la puntuación de Derkay, una medida de gravedad, mostraron una correlación positiva débil (r = 0,23, p = 0,07) (Fig. 7A). Por el contrario, p16 IHC, un marcador sustituto del VPH en el carcinoma orofaríngeo, y las puntuaciones de Derkay mostraron una correlación negativa débil (r = − 0,23, p = 0,06) (Fig. 7B). Dado que la positividad de IHC L1 y la puntuación de Derkay estaban asociadas, esperábamos que la carga viral del VPH y E2/E6 estuvieran correlacionadas con la puntuación de Derkay; sin embargo, no se observó correlación (r = − 0,004, p = 0,976 y r = 0,006, p = 0,966, respectivamente) (Fig. 7C,D).

Gráficos de dispersión y líneas de regresión para la puntuación de Derkay. (A) El índice MIB-1 y la puntuación de Derkay muestran una correlación positiva débil (r = 0,23, p = 0,07). (B) Las puntuaciones de P16 IHC y Derkay muestran una correlación negativa débil (r = − 0,23, p = 0,06). (C) La carga viral y las puntuaciones de Derkay no muestran correlación (r = − 0,004, p = 0,976). (D) Las puntuaciones E2/E6 y Derkay no muestran correlación (r = 0,006, p = 0,966). (E) No hay una tendencia significativa en el cambio medio de la puntuación de Derkay en cada momento de la cirugía. (F) El intervalo quirúrgico y la puntuación de Derkay muestran una correlación negativa (r = − 0,40, p = 0,01). Inmunohistoquímica IHC, puntuación DS Derkay.

No se observó una tendencia significativa en el cambio medio en la puntuación de Derkay en cada momento de la cirugía (Fig. 7E). El intervalo quirúrgico y la puntuación de Derkay mostraron una correlación negativa (r = − 0,40, p = 0,01) (Fig. 7F). Esto muestra que el intervalo quirúrgico podría ser un indicador útil de la gravedad.

El VPH es un virus de ADN de doble cadena de aproximadamente 50 a 60 nm de tamaño sin envoltura23. Dado que el ADN del VPH se detecta en la mucosa laríngea en remisión, se cree que la infección persistente es la patogénesis de RRP13. En este estudio, IHC reveló que L1, que es una proteína de la cápside, y E4, que está involucrada en la formación de partículas de VPH24,25, estaban correlacionadas en el tejido RRP. Además, la observación de células positivas para IHC L1 mediante NanoSuit-CLEM y TEM reveló que los núcleos estaban llenos de micropartículas de aproximadamente 50 a 60 nm de tamaño, mientras que no se observaron hallazgos similares en los núcleos de células negativas para IHC L1, lo que indica que estas partículas eran partículas de VPH. Además, este estudio sugiere que las partículas de VPH comienzan a formar la capa superficial del tumor y aumentan en número a medida que se mueven hacia arriba. Este estudio demostró por primera vez que las partículas de VPH se producen continuamente en RRP grave, lo que puede provocar una infección persistente. En otras palabras, visualizamos con éxito parte del ciclo de vida del VPH en las secciones de RRP con FFPE.

Este estudio también se centró en la participación del VPH. Se informa que la frecuencia del VPH supera el 80 % según los artículos recientes sobre RRP4,5,6, pero algunos informes demostraron una participación del VPH de aproximadamente el 60 %1,2. También existen informes en los que se ha realizado un diagnóstico clínico sin examinar si el VPH está involucrado o no7,8,9. Examinamos el VPH por PCR, L1 IHC, E4 IHC y qPCR para E2/E6, todos los cuales son indetectables en casos de VPH negativos. Estos resultados indican la presencia de casos VPH negativos incluso en casos patológicos de papiloma diagnosticados clínicamente como PRR. En la PL de inicio en el adulto, el grupo de edad fue menor para los casos VPH positivos. Se han informado mutaciones genéticas en RAS en casos VPH negativos26. Podrían ser mayores ya que la mutación genética es la etiología principal. Los datos actuales también mostraron una tendencia hacia una mayor edad en el PRR negativo para VPH. Por otro lado, la edad de los tipos de VPH 6 y 11 positivos RRP no fue diferente en muchos informes; por lo tanto, la diferencia significativa en este estudio podría atribuirse al pequeño tamaño de la muestra.

Debido al amplio rango de gravedad de la PRR, es crucial determinar la gravedad de la enfermedad. El puntaje Derkay es una herramienta de evaluación ampliamente utilizada. Un estudio que examinó a 721 pacientes con PRR de inicio juvenil informó que una puntuación alta de Derkay era un factor de riesgo de recurrencia27. Sin embargo, dos limitaciones de la puntuación de Derkay son que la puntuación no puede predecir el sitio de recurrencia y la puntuación puede variar de evaluador a evaluador ya que no existen criterios claros para el tamaño del tumor u otros factores. Otro factor de riesgo bien conocido es la afectación del VPH tipo 1127,28,29. En este estudio, el número de cirugías no difirió entre los tipos de VPH 6 y 11; sin embargo, hubo una diferencia estadísticamente significativa entre los pacientes VPH positivos y VPH negativos. Además, encontramos que el intervalo quirúrgico fue más corto y el número de cirugías fue mayor en los casos positivos para L1 IHC, lo que indica una producción activa de partículas de VPH. Estos hallazgos sugieren que la producción persistente de partículas de VPH, que da como resultado una infección persistente, es la patogenia principal de la PRR. Se ha informado que la combinación de cirugía y vacunación contra el VPH reduce el riesgo de recurrencia30,31. Estos informes apoyan esta hipótesis. El tiempo hasta el diagnóstico podría ser un factor de confusión. Sin embargo, al observar los casos positivos de L1 IHC en este estudio, tienden a ser positivos independientemente de las cirugías realizadas (Fig. 5A y Tabla complementaria S1, Caso 5, 8, 22, 23). Además, incluso los intervalos quirúrgicos cortos pueden ocurrir con L1 IHC-positivo. Así, factores del paciente, como la respuesta inmune, podrían ser más relevantes que el tiempo. Además, encontramos que la positividad de L1 IHC se asoció con una puntuación alta de Derkay; sin embargo, L1 IHC y Derkay score podrían evaluar diferentes aspectos. Es poco probable que la puntuación de Derkay se considere alta sin múltiples lesiones y no puede evaluar la fisiopatología de la infección persistente por VPH. Además, L1 IHC no puede evaluar todo el tumor porque solo evalúa el tejido en el portaobjetos de vidrio; sin embargo, demuestra una fuerte evidencia de producción activa de partículas de VPH. Por lo tanto, la puntuación de Derkay y la formación de partículas de VPH podrían evaluar diferentes aspectos de la RRP. Por el contrario, se observó una correlación negativa débil entre la puntuación de Derkay y p16 IHC, un marcador sustituto conocido para HPV32,33. Por lo tanto, sugerimos la prueba de L1 IHC además de la puntuación de Derkay para evaluar con precisión la gravedad de la RRP.

También examinamos la carga viral y el estado físico. La carga viral no difirió entre los tipos de VPH 6 y 11, pero el tipo de VPH 11 fue dominante de tipo integrado. Por el contrario, la carga viral y el estado físico no se correlacionaron con el índice MIB-1. Además, la carga viral y el estado físico no se correlacionaron con la puntuación de Derkay. Informes previos revelaron que la carga viral disminuyó progresivamente con cada cirugía hasta lograr la remisión34, mientras que otros mostraron que la carga viral y el estado físico no están relacionados con el volumen del tumor22; por lo tanto, no existe consenso. La carga viral varió ampliamente dentro del mismo caso. La carga viral puede variar según el sitio que se esté muestreando. Sin embargo, dado que las muestras no se tomaron por separado para cada subsitio, no pudimos examinar este punto. Se requiere más investigación para dilucidar estos hallazgos; sin embargo, la carga viral y el estado físico no parecen ser indicadores de gravedad clínica.

Identificamos partículas de VPH en secciones de FFPE y la observación de partículas de VPH se asoció con la gravedad de la RRP. Sin embargo, este estudio tuvo varias limitaciones. El número de casos en este estudio fue pequeño, aunque 29 casos pueden considerarse una muestra relativamente grande para un estudio de RRP. Este estudio no incluyó la PRR de inicio juvenil, los pacientes vacunados contra el VPH y las lesiones del tracto respiratorio inferior; por lo tanto, aún no está claro si L1 IHC es eficaz en tales casos. Aunque el intervalo de recurrencia en lugar del intervalo quirúrgico parece ser un mejor indicador, el intervalo quirúrgico se utilizó como indicador en este estudio ya que determinar con precisión el momento de la recurrencia fue un desafío. Sin embargo, dado que el intervalo quirúrgico se correlaciona con la puntuación de Derkay, puede ser un indicador útil de la gravedad. Todos los pacientes con transformación maligna eran VPH negativos. Un informe de Taiwán sugirió que el estado VPH negativo es un factor de riesgo para la transformación maligna35. Por tanto, aunque el estado VPH negativo podría ser un factor de riesgo de transformación maligna, no estudiamos este punto en detalle.

En conclusión, utilizando NanoSuit-CLEM y TEM, logramos por primera vez visualizar una parte del ciclo de vida del VPH de RRP en secciones FFPE. La infección persistente con partículas de VPH debido a la producción continua de partículas de VPH se correlaciona con la gravedad clínica. L1 IHC es importante para evaluar la gravedad de la RRP además de la puntuación de Derkay.

Se obtuvieron sesenta y ocho muestras de RRP de 29 pacientes que se sometieron a cirugía en la Facultad de Medicina de la Universidad de Hamamatsu, el Hospital General Seirei Hamamatsu, el Hospital General Seirei Mikatahara y el Hospital General Municipal de Fujieda. Las muestras se obtuvieron desde septiembre de 2005 hasta junio de 2021. Todos los casos fueron diagnosticados patológicamente como papiloma antes de ser incluidos en el estudio. En todos los casos se realizó cada vez la extirpación total del tumor, y se excluyeron los casos en los que quedó tumor. Siempre que fue posible, la cirugía se realizó a los pocos meses de observar la recurrencia. El protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Hamamatsu (número de aprobación: 19–222). Todos los métodos se realizaron de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. La información médica, incluida la edad del paciente, el sexo, la exposición al alcohol, el tabaquismo, la puntuación de Derkay y la fecha de la cirugía, se recuperó de los registros de los pacientes.

El Derkay Score es un método de evaluación de la gravedad ampliamente utilizado. La fórmula de la puntuación de Derkay es "la suma de los puntos calculados a partir del tamaño del tumor en cada sitio" más "los puntos calculados a partir de los hallazgos clínicos". La evaluación del tamaño del tumor se basa en el tracto aerodigestivo dividido en 25 subsitios, cada uno de los cuales recibe una puntuación de 0 a 3 (0 = sin lesión, 1 = lesión superficial, 2 = lesión elevada y 3 = lesión voluminosa). La evaluación de los hallazgos clínicos se basa en la voz del paciente (0 = normal, 1 = anormal y 2 = afónico), el estridor del paciente (0 = ausente, 1 = presente con actividad y 2 = presente en reposo), la urgencia de la intervención de hoy (0 = programada, 1 = electiva, 2 = urgente y 3 = emergente), y nivel de dificultad respiratoria (0 = ninguna, 1 = leve, 2 = moderada, 3 = grave y 4 = extrema)12.

Se tomaron muestras de tejido para la extracción de ADN del área con el mayor volumen tumoral. En los casos en que el muestreo de tejido para este estudio fue inadecuado, se extrajo ADN de tejido FFPE. El ADN se extrajo utilizando un kit QIAamp DNA Mini o un kit QIAamp DNA FFPE Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania). Se utilizó el conjunto de cebadores TaKaRa PCR Human Papillomavirus Typing Set (Takara Bio, Kusatsu, Japón) para detectar el VPH. Las muestras que se detectaron como VPH positivas mediante PCR se sometieron a un análisis de secuenciación directa con un analizador genético 3500xL (Applied Biosystems, Waltham, MA, EE. UU.). El tipo de VPH se determinó mediante la búsqueda de secuencias mediante BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

La carga viral de VPH tipo 6 u 11 y el estado físico se evaluaron mediante qPCR utilizando el sistema de PCR en tiempo real StepOne (Applied Biosystems, Waltham, MA, EE. UU.). Se diseñaron cebadores para HPV tipo 6 y 11 específicos E2 y E6, y actina beta (Tabla complementaria S2). Las curvas estándar para E2, E6 y actina beta se establecieron usando un plásmido de clonación como se describió anteriormente21,22,34. El número de copias de E6 por nanogramo de ADN se definió como la carga viral. La proporción del número de copias E2/número de copias E6 representa el estado físico del VPH. E2/E6 < 1 indica que existen formas tanto integradas como episomales (mixtas), E2/E6 ≥ 1 indica el predominio de la forma episomal y E2/E6 = 0 indica solo una forma integrada36.

Se prepararon secciones de tejido FFPE (4 μm de espesor). La recuperación de antígeno se realizó utilizando la solución de recuperación de epítopos pH 9 (Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania). Para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena, las secciones se incubaron en una solución de H2O2 al 0,3 % en metanol. Se usó suero de cabra al diez por ciento (Nichirei Bioscience, Tokio, Japón) para bloquear las secciones. Los anticuerpos principales utilizados fueron el anticuerpo HPV-L1 (K1H8) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), p16 (E4H6) (Roche, Basilea, Suiza) y Ki-67 (MIB-1) (DAKO, Santa Clara). , CA, EE. UU.). También se utilizaron anticuerpos E4 del VPH tipo 6 y E4 tipo 11, como se describió anteriormente21. Para los anticuerpos secundarios, se utilizó un kit MAX-PO(M) o MAX-PO(R) (Nichirei Bioscience, Tokio, Japón). Las secciones se visualizaron con DAB.

La doble tinción de L1 y E4 se realizó con L1 y se visualizó con DAB, y E4 se visualizó con el kit de sustrato ImmPACT Vector Red AP (Vector Laboratories, Newark, CA, EE. UU.).

Las evaluaciones de IHC fueron realizadas de forma independiente por dos patólogos que desconocían la información del paciente. La IHC se evaluó como positiva o negativa para L1 y E4, el índice MIB-1 se calculó como porcentaje de células positivas para Ki-67 IHC/células tumorales totales, y p16 se calculó como la puntuación inmunorreactiva (IRS) utilizando la intensidad de tinción como porcentaje de las células tumorales positivas (Supl. Fig. S2)37.

Se utilizaron sondas HPV tipo 6 E4 y tipo 11 E4. El protocolo fue descrito previamente21,22. Brevemente, se prepararon sondas marcadas con digoxigenina y se hibridaron durante la noche a 60 °C. La detección se realizó mediante solución de nitroazul de tetrazolio/5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato.

Se realizó IHC con anticuerpo L1 (teñido con DAB). A continuación, se obtuvieron imágenes de las zonas a observar por FE-SEM. Los portaobjetos se incubaron con solución de osmio al 1% durante 5 min. El osmio reacciona específicamente con DAB y mejora cuando se observa con FE-SEM38. La deposición de vapor de osmio se realizó utilizando un recubridor de osmio (HPC-1SW) (dispositivo de vacío, Mito, Japón). Se utilizó el microscopio electrónico de barrido de emisión de campo Hitachi S-4800 (Hitachi, Tokio, Japón) para las observaciones FE-SEM y se operó a un voltaje de aceleración de 5,0 kV. Las imágenes se capturaron en el modo de electrones retrodispersados ​​de itrio-aluminio-granate (YAG-BSE).

Secciones de tejido FFPE. (8 μm de espesor) se prepararon utilizando vidrio no revestido. Se aplicó NanoSuit Solution II (Nisshin EM, Tokio, Japón) a los portaobjetos, que se giraron 3000 rpm mediante un recubridor giratorio para crear una nanopelícula. Luego, se realizaron observaciones FE-SEM. Las secciones de tejido FFPE en portaobjetos de vidrio se volvieron a fijar con glutaraldehído al 2 % y tetróxido de osmio al 2 %, y se incluyeron en resina epoxi (Nisshin EM, Tokio, Japón). Se cortaron bloques (0,5 mm2) para unificar el área de observación FE-SEM. Se prepararon portaobjetos ultrafinos (60–80 nm) y se tiñeron con acetato de plomo y acetato de uranio. JEM-1400 (JEOL, Tokio, Japón) se utilizó para las observaciones de microscopía electrónica de transmisión (TEM).

Los datos de las dos poblaciones en las dos categorías se sometieron a la prueba exacta de Fisher. La prueba exacta de Fisher se realizó utilizando pruebas de dos colas. Los datos relevantes incluyeron sexo, tabaquismo, alcohol y transformación maligna. Se aplicó la prueba t de Welch para comparar los dos conjuntos de datos. Se realizó una prueba t de Welch utilizando pruebas de dos colas. Los datos relevantes incluyeron la edad, el número total de cirugías, la puntuación de Derkay, los datos de IHC y la carga viral. Dado que estos datos no mostraron homogeneidad de varianza, se realizó la prueba t de Welch. Se utilizó el coeficiente de correlación producto-momento de Pearson para evaluar la fuerza de la relación lineal entre los dos datos o variables aleatorias. Se aplicó un análisis de regresión logística binomial para determinar la asociación entre L1 IHC y el Derkay Score. La significación estadística se fijó en p < 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS ver.26 (IBM Corp., Armonk, NY, EE. UU.) y KyPlot ver.6.0.2 (KyensLab, Tokio, Japón).

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

Orita, Y. et al. El papiloma de células escamosas de laringe está altamente asociado con el virus del papiloma humano. Jpn. J. Clin. oncol. Rev. 48, 350–355 (2018).

Artículo PubMed Google Académico

Davids, T., Muller, S., Wise, JC, Johns, MM y Klein, A. Displasia asociada a la papilomatosis laríngea en la población adulta: una actualización sobre la prevalencia y la subtipificación del VPH. Ana. Otol. Rinol. laringol. 123, 402–408 (2014).

Artículo PubMed Google Académico

Rivera, GA & Morell, F. Papilomas laríngeos (StatPearls Publishing, 2022).

Google Académico

Amiling, R. et al. Papilomatosis respiratoria recurrente de inicio juvenil en los Estados Unidos, epidemiología y tipos de VPH: 2015-2020. J. Infección pediátrica. Dis. Soc. 10, 774–781 (2021).

Artículo PubMed Google Académico

Bedard, MC et al. La cepa de VPH predice la gravedad de la papilomatosis respiratoria recurrente de inicio juvenil con implicaciones para la detección de enfermedades. Cánceres (Basilea) 13, 2556 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Carvalho, AMAS et al. Papilomatosis respiratoria recurrente: características clínicas y genotipado viral en una población brasileña. Inst. Rev. Medicina. trop. São Paulo 63, e63 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Tkaczuk, A. et al. Bevacizumab parenteral para el tratamiento de la papilomatosis respiratoria grave en una población adulta. Laringoscopio 131, E921–E928 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Benedicto, PA et al. Estudio prospectivo multicéntrico de la distribución anatómica de la papilomatosis respiratoria recurrente. Laringoscopio 132, 2403–2411 (2022).

Artículo PubMed Google Académico

Robbins, Y. et al. Bloqueo dual de PD-L1 y TGF-b en pacientes con papilomatosis respiratoria recurrente. J. Immunother. Cáncer 9, 1–9 (2021).

Artículo Google Académico

Kanazawa, T. et al. Caso raro de transformación maligna de papilomatosis respiratoria recurrente asociada a infección por virus del papiloma humano tipo 6 y sobreexpresión de p53. Springerplus 2, 2–7 (2013).

Artículo Google Académico

Allen, CT et al. Seguridad y actividad clínica del bloqueo de PD-L1 en pacientes con papilomatosis respiratoria recurrente agresiva. J. Immunother. Cáncer 7, 1–9 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Derkay, CS et al. Un sistema de estadificación para evaluar la gravedad de la enfermedad y la respuesta al tratamiento en la papilomatosis respiratoria recurrente. Laringoscopio 108, 935–937 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Steinberg, BM, Topp, WC, Schneider, PS & Abramson, AL Infección por el virus del papiloma laríngeo durante la remisión clínica. N. ingl. J.Med. 308, 1261–1264 (1983).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Takaku, Y. et al. Una fina membrana de polímero, nanotraje, que mejora la supervivencia en el continuo entre el aire y el alto vacío. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 110, 7631–7635 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hariyama, T. et al. Microscopía y biomimética: el método NanoSuit® y la plataforma de recuperación de imágenes. Microscopía (Oxford) 71, 1–12 (2022).

Artículo CAS Google Académico

Kawasaki, H. et al. El método NanoSuit: un enfoque histológico novedoso para examinar secciones de parafina de manera no destructiva mediante microscopía correlativa de luz y electrónica. Laboratorio. Invertir. 100, 161–173 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Shinmura, K. et al. Utilidad del análisis elemental por microscopía electrónica de barrido utilizando el método de microscopía óptica y electrónica correlativa 'NanoSuit' en el diagnóstico del depósito de fosfato de lantano en la mucosa esofagogastroduodenal. Diagnóstico 10, 1 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Ooishi, M. et al. Diagnóstico de depósitos de resinas de intercambio iónico en cortes de parafina utilizando el método de nanotraje de microscopía óptica y electrónica correctiva. Diagnóstico 11, 1193 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shinmura, K. et al. Identificación y caracterización de tumores primarios de glándulas salivales con cilios positivos que exhiben diferenciación basaloide/mioepitelial. J. Pathol. 254, 519–530 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Itoh, T. et al. Identificación de partículas de virus de progenie activa en secciones fijadas con formalina e incluidas en parafina utilizando microscopía correlativa de luz y electrónica de barrido. Laboratorio. Invertir. 103, 100020 (2023).

Artículo PubMed Google Académico

Ikegami, T. et al. Desarrollo de anticuerpos contra HPV-6 y HPV-11 para el estudio del papiloma laríngeo. Virus 13, 1–14 (2021).

Artículo Google Académico

Ikegami, T. et al. Expresión coordinada de genes HPV-6 con expresión predominante de E4 y E5 en papiloma laríngeo. Microorganismos 9, 1–18 (2021).

Artículo Google Académico

Doorbar, J. et al. La biología y el ciclo de vida de los virus del papiloma humano. Vacuna 30, F55–F70 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Doorbar, J. La proteína E4; estructura, función y patrones de expresión. Virología 445, 80–98 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wakabayashi, R., Nakahama, Y., Nguyen, V. & Espinoza, JL La interacción huésped-microbio en la carcinogénesis inducida por el virus del papiloma humano. Microorganismos 7, 1–22.

Artículo Google Académico

Sasaki, E., Masago, K., Fujita, S., Hanai, N. y Yatabe, Y. Mutaciones frecuentes de KRAS y HRAS en papilomas de células escamosas de la cabeza y el cuello. J. Pathol. clin. Res. 6, 154–159 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qu, X., Xiao, Y., Ma, L., Niu, Z. & Wang, J. Alta tasa de recurrencia en pacientes con papilomatosis respiratoria de inicio juvenil y sus factores de riesgo. EUR. Arco. Otorrinolaringol. 279, 4061–4068 (2022).

Artículo PubMed Google Académico

Gerein, V., Rastorguev, E., Gerein, J., Draf, W. & Schirren, J. Incidencia, edad de inicio y posibles razones de transformación maligna en pacientes con papilomatosis respiratoria recurrente: 20 años de experiencia. otorrinolaringol. Cirugía de Cabeza y Cuello 132, 392–394 (2005).

Artículo PubMed Google Académico

Reidy, PM y col. Integración del virus del papiloma humano tipo 11 en el cáncer asociado al papiloma respiratorio recurrente. Laringoscopio 114, 1906-1909 (2004).

Artículo PubMed Google Académico

Smahelova, J. et al. Resultados después de la vacunación contra el virus del papiloma humano en pacientes con papilomatosis respiratoria recurrente: un ensayo clínico no aleatorizado. JAMA Otorrinolaringol. Cirugía de Cabeza y Cuello 148, 654–661 (2022).

Artículo PubMed Google Académico

Matsuzaki, H. et al. Efecto multianual de la vacunación contra el virus del papiloma humano en la papilomatosis respiratoria recurrente. Laringoscopio 130, 442–447 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Klingenberg, B. et al. La sobreexpresión de P16INK4A se detecta con frecuencia en tejido de amígdalas sin tumor y sin asociación con el VPH. Histopatología 56, 957–967 (2010).

Artículo PubMed Google Académico

Singhi, AD & Westra, WH Comparación de la hibridación in situ del virus del papiloma humano y la inmunohistoquímica de p16 en la detección del cáncer de cabeza y cuello asociado al virus del papiloma humano según una experiencia clínica prospectiva. Cáncer 116, 2166–2173 (2010).

Académico de Google de PubMed

Deng, Z. et al. Metilación de sitios CpG en la región reguladora aguas arriba, estado físico y expresión de ARNm de VPH-6 en papiloma laríngeo de inicio en adultos. Oncotarget 8, 85368–85377 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Lee, LA et al. Alta incidencia de transformación maligna del papiloma laríngeo en Taiwán. Laringoscopio 118, 50–55 (2008).

Artículo PubMed Google Académico

Ikegami, T. et al. Detección del virus del papiloma humano en quistes de hendidura branquial. oncol. Letón. 16, 1571–1578 (2018).

PubMed PubMed Central Google Académico

Remmele, W. & Stegner, HE Recomendación para la definición uniforme de una puntuación inmunorreactiva (IRS) para la detección inmunohistoquímica de receptores de estrógeno (ER-ICA) en tejido de cáncer de mama. Patólogo. 8, 138–140 (1987).

CAS PubMed Google Académico

Arai, Y. et al. La técnica de mejora de metales pesados ​​para diaminobencidina en inmunohistoquímica permite la observación ultraestructural mediante microscopía electrónica de barrido de bajo vacío. J. Histochem. citoquímica. 70, 427–436 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Descargar referencias

Los autores desean agradecer a Yoshiro Otsuki, Isao Ohta, Yuko Mohri y Hiromi Suzuki por su excelente soporte técnico. Además, agradecemos al Centro Preeminente de Investigación y Educación en Fotónica Médica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Hamamatsu por permitirnos utilizar su equipo.

Este estudio fue financiado por una Subvención de Ayuda para la Investigación Científica, Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (Nos. 20K09689, 20K18249, 20K18250 y 20K18277) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón. y una subvención de HUSM.

Departamento de Otorrinolaringología/Cirugía de Cabeza y Cuello, Facultad de Medicina de la Universidad de Hamamatsu, 1-20-1 Handayama Higashi-ku, Hamamatsu, Shizuoka, 431-3192, Japón

Satoshi Yamada, Atsushi Imai, Daiki Mochizuki, Hiroshi Nakanishi, Ryuji Ishikawa, Junya Kita, Yuki Nakamura, Yoshinori Takizawa y Kiyoshi Misawa

Preeminent Medical Photonics Education and Research Center Institute for NanoSuit Research, Hamamatsu University School of Medicine, 1-20-1 Handayama Higashi-ku, Hamamatsu, Shizuoka, 431-3192, Japón

Satoshi Yamada, Toshiya Itoh, Takahiko Hariyama y Hideya Kawasaki

Departamento de Obstetricia y Ginecología, Facultad de Medicina de la Universidad de Hamamatsu, Hamamatsu, Japón

Toshiya Itoh

Departamento de Otorrinolaringología, Cirugía de Cabeza y Cuello, Facultad de Medicina de la Universidad de Ryukyus, Okinawa, Japón

Taro Ikegami y Mikio Suzuki

Departamento de Otorrinolaringología, Hospital General Seirei Hamamatsu, Hamamatsu, Japón

Jun Okamura

Departamento de Otorrinolaringología, Hospital General Seirei Mikatahara, Hamamatsu, Japón

yoshihiro noda

Departamento de Patología Regenerativa e Infecciosa, Facultad de Medicina de la Universidad de Hamamatsu, Hamamatsu, Japón

Toshihide Iwashita y Hideya Kawasaki

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

HK, KM y SY concibieron el estudio y diseñaron los experimentos. SY, TI, TI, DM, RI, YT, JO y YN realizaron experimentos. SY, AI, HN, JK, YN, TI, TH, MS y KM realizaron análisis de datos. Todos los autores escribieron el manuscrito, revisaron sus borradores, aprobaron la versión final y estuvieron de acuerdo con su presentación.

Correspondencia a Kiyoshi Misawa o Hideya Kawasaki.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Yamada, S., Itoh, T., Ikegami, T. et al. Asociación entre la producción de partículas del virus del papiloma humano y la gravedad de la papilomatosis respiratoria recurrente. Informe científico 13, 5514 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32486-8

Descargar cita

Recibido: 23 enero 2023

Aceptado: 28 de marzo de 2023

Publicado: 06 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32486-8

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.